New Phytologist（IF=8.1） ▏DAP-seq助力揭示杂交枫香再生调控新机制

2025年08月22日 10:06:36 人气: 834 来源: 蓝景科信河北生物科技有限公司

2025年6月，北京林业大学张金凤团队在《New Phytologist》（IF=8.1）上发表了一篇题目为“BZR2-GRF5 acts as a hub module in regulating in vitro regeneration through brassinosteroid–auxin crosstalk in hybrid sweetgum”的研究论文，本文借助DAP-seq技术，揭示了BZR2-GRF5转录调控模块通过组织特异性调控生长素外排基因LsfWAG2，介导油菜素内酯（BR）与生长素（IAA）信号互作，双向调控体细胞胚胎发生（SE）与器官再生的分子机制，为木本植物再生机制研究与遗传改良提供了全新视角。

研究背景

木本植物离体再生是种质资源扩繁、保存及遗传改良的关键技术，主要通过体细胞胚胎发生（SE）和器官发生两条途径实现。枫香是重要林木资源，杂交枫香因生长快、木材密度高，具有显著优势，但其再生体系存在愈伤诱导率低、芽再生效率低等问题。油菜素内酯（BR）与生长素是调控植物再生的关键激素，BZR转录因子通过靶向生长素信号组分（如PIN, ARF）影响激素合成与运输。此前研究发现外源epiBR需与生长素联用才能诱导杂交枫香SE，提示BZR基因可能是再生通路的关键调控因子，但其作用机制尚不清楚。

技术路线

研究结果

本研究利用Hidden Markov 模型从杂交枫香基因组中鉴定出8个BZR家族基因，组织特异性表达谱显示LsfBZR1/2在胚性愈伤组织（EC）及胚胎发生阶段特异性高表达。通过酵母双杂交（Y2H）、荧光素酶互补成像（LCI）、蛋白Pull-down、亚细胞定位多种实验，证实LsfBZR2与生长调节因子LsfGRF2/3/5存在直接蛋白互作，且发生在细胞核内。其中LsfGRF5互作效应最为显著。GRF家族是植物生长发育的关键转录因子，提示LsfBZR1/2可能通过与GRF蛋白互作调控再生。

图1 杂交枫香中LsfBZR1/2的表达模式及序列分析。

为了进一步验证BZR2-GRF5模块功能，构建了LsfBZR2及LsfGRF5过表达株系。表型分析表明，LsfBZR2-OE、LsfGRF5-OE株系均表现为鲜重增加；体细胞胚胎数量减少，且异常胚胎比例显著升高；再生芽生长速率加快且形成密集芽簇。qRT-PCR显示过表达株系基因表达显著上调，且植株表型正常，证实该模块对器官发生有正向调控作用。

图2 过表达LsfBZR2促进杂交枫香愈伤组织增殖并抑制其胚胎发生能力。

图3 过表达LsfBZR2正向调控杂交枫香离体器官发生中的芽再生。

图4 LsfBZR2与杂交枫香中的LsfGRF2、LsfGRF3和LsfGRF5发生互作。

图5 LsfGRF5增强杂交枫香的愈伤组织增殖能力，同时抑制体细胞胚胎的形成。

图6 过表达LsfGRF5促进杂交枫香的芽再生。

为了鉴定LsfBZR2调控的下游基因，作者采用DNA亲和纯化测序（DAP-seq）技术来识别该转录因子结合的基因组DNA元件。结果显示LsfBZR2在36,582个基因组位点高度富集，涵盖8,454个基因。其中12.2%位于启动子区域，核心结合基序为‘CACGTG’。GO富集结果表明，与LsfBZR2蛋白结合位点相关的基因主要富集在锌离子稳态维持、分生组织发育、表观遗传学、减数分裂、乙醛酸循环和脱落酸代谢途径。与RNA-seq数据联合分析筛选出457个受LsfBZR2调控的差异基因，其中生长素外排载体基因LsfWAG2（Lsf07G005650）被确认为直接靶基因。qRT-PCR与LC-MS/MS结果显示，在SE途径中，LsfBZR2过表达抑制LsfWAG2表达，导致IAA积累，促进愈伤增殖；在器官发生途径中，LsfBZR2激活LsfWAG2表达，加速生长素外排使IAA水平降低，从而促进芽原基形成。酵母单杂交（Y1H）与双荧光素酶报告实验（DLR）证实，LsfBZR2直接结合启动子区并调控其转录活性。

图7 杂交枫香中LsfBZR2可结合LsfWAG2基因启动子以调控生长素运输。

本研究建立了杂交枫香中BR-生长素信号互作的分子调控模型：BZR2-GRF5模块通过差异化调控LsfWAG2表达，在SE中维持高生长素环境促进愈伤增殖，在器官发生中降低生长素水平以加速芽再生，形成组织特异性的双向调控机制。这一发现为木本植物再生效率的遗传改良提供了新靶点，并揭示了BR-生长素互作在组织特异性发育中的精准调控机制。

图8 LsfBZR2-LsfGRF5模块介导生长素信号调控杂交枫香植株体外再生的工作模型。

关键词： DAP-seq,转录因子,杂交枫香

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