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分子生物学
fzswx.ybzhan.cn仪表网旗下想做DAP-seq实验，却满脑子疑问？别担心，这篇攻略为你一次性解答所有关键问题，助你轻松开启实验之旅！
一、DAP-seq是什么？能帮我解决啥问题？
DAP-seq技术的核心原理
先在体外表达带有特定标签（如His、Halo标签）的目的蛋白，让其与标签配体结合后，再与基因组DNA共同孵育，最后洗脱结合的DNA片段进行高通量测序和生物信息分析。
核心优势
它能帮你快速锁定转录因子的结合位点，找到其调控的下游靶基因。更给力的是，这项技术无需特异性抗体，无需转基因材料，即可揭示转录因子与DNA的互作网络，如今已成为植物学、微生物学等领域解析基因表达调控网络的关键技术手段。
蓝景科信DAP-seq技术流程
二、实验前，我需要准备哪些材料？
（1）样本材料
- 组织材料：植物组织5g、动物组织2g、微生物2g；或提取好的基因组DNA 10μg（可根据DNA提取效率适当调整样本量）。
-含有转录因子CDS序列的质粒：需附带测序无误的报告（序列准确性至关重要，否则会严重影响实验周期）。
（2）组织部位如何选取？
若蛋白表达有组织或时空特异性，优先选择对应时期的组织——因为我们常规DAP-seq流程采用PCR-free建库的方式，尽可能保留DNA修饰，而这些修饰可能影响蛋白与DNA的结合。
我们已完成3000+项目，植物的根、茎、叶、果实、种子等组织均有成功提取经验。若提取失败，可更换易提取的组织重试。此外，还可提供去除DNA修饰的ampDAP-seq流程。
（3）参考基因组用什么版本？
参考基因组建议优先选择您日常分析中常用的版本，如果后续需要将DAP-seq数据与其他实验数据（如RNA-seq、ATAC-seq等）进行联合分析，请务必保证所有数据使用相同版本的参考基因组，这样才能确保分析结果的准确性和一致性。
三、测序量和重复怎么定？
（1）测序量：
- 常规推荐：基因组的3X-5X。
- 需增加测序量的情况：
- 物种与参考基因组匹配度低，导致比对率低。
- 根部组织微生物含量高，可能降低比对率。
（2）重复设置：
我们的标准流程包含一个input对照和两个技术重复，无需额外设置重复，可满足文章发表需求（目前合作项目已发表于多个层次期刊）。
小知识：input对照是什么？
Input对照是亲和纯化前的文库，即基因组DNA文库，作用是在分析时降低背景噪音。
四、特殊情况说明
（1）哪些样品不能做？
- 无参考基因组的物种。
- 转录因子无法在体外表达的情况。
除上述两种，我们会提供可行性分析报告供参考。
（2）为什么有些基因家族成功率低？
部分转录因子需要和其他蛋白形成复合体才能与DNA结合，这些蛋白的实验风险比较高。
五、分析结果包含哪些内容？
蓝景科信DAP-seq的生信分析包含以下内容：
1. 原始数据处理（去接头、污染序列及低质量reads）
2. 数据产出统计
3. 参考序列比对分析
4. 测序reads富集区域扫描（peak calling）
5. Peak在基因功能元件上的分布统计
6. Peak序列模式发掘（motif search）
7. 已知motif注释
8. Peak相关基因鉴定
9. Peak相关基因的GO和KEGG富集分析
10. 测序数据的可视化分析
六、DAP-seq、ChIP-seq、Cut&Tag怎么选？
选择建议：
对于ChIP实验，需要足够多的蛋白，为此常常将该TF过表达，然后在特定组织部位获得该蛋白，同时需要特异性的抗体，这两点关系到实验的成功与否。Cut&Tag相比ChIP-seq的优势是样本投入量少，信噪比高，但是同样需要抗体，而且对样本的活性状态要求很高，不兼容长期冻存样本。如果您已有转基因材料，且有ChIP级别抗体的话，ChIP实验还是值得尝试的，毕竟能够拿到体内结果，若难以满足上述条件，且时间、经费有限，建议您优先考虑DAP-seq实验。
七、结果如何验证？
拿到结果之后需要挑选您感兴趣的靶基因，之后就要开始验证环节，文献中常用的验证实验方法包括：ChIP-qPCR、酵母单杂交、EMSA、双荧光素酶报告实验，我们可提供相关技术支持。
八、有哪些成功案例？
蓝景科信已完成200+物种，3000+转录因子的实验，周期短，口碑好，助力客户发表高分文章Cell，Molecular Plant，Plant Biotechnology Journal，Plant Cell，PNAS，Plant Communications，Journal of Integrative Plant Biology，New Phytologist，International Journal of Biological Macromolecules，Horticulture Research，Plant Physiology等。
已做物种：
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